Guignardia citricarpa
Organisation Européenne et Méditerranéenne pour la Protection des Plantes
Specific scope
This standard describes a diagnostic protocol for Guignardia citricarpa.
Champ d’application spécifique
Cette norme décrit un protocole de diagnostic pour Guignardia citricarpa.
Specific approval and amendment
First approved in 2002-09.
Approbation et amendement spécifique
Première approbation en 2002-09.
Introduction
Guignardia citricarpa is a damaging pathogen on Citrus spp., occurring in many areas where Citrus is cultivated including Asia, Australia, South America and Southern Africa (EPPO/CABI, 1997). The disease has not been reported from Europe or North America. It is mainly a foliage and fruit disease, causing blemishes of the rind (‘black spot’) which makes the fruits unfit for the fresh-fruit market. Heavy infection near the pedicel of the developing fruit may lead to premature fruit drop. Losses may be substantial and costs for chemical control can be significant.
Phytosanitary regulations cover fruits of Citrus, Fortunella, Poncirus and their hybrids1, other than fruits of resistant Citrus aurantium. They should originate from countries or areas recognized to be free from ‘pathogenic strains’ of G. citricarpa or at least the orchard and the fruits should be free from symptoms caused by ‘pathogenic strains’ of G. citricarpa. The regulations refer to strains of G. citricarpa pathogenic to citrus because non-pathogenic, endophytic strains of G. citricarpa have been reported from symptomless Citrus plants as well as from host plants other than Citrus (Chiu, 1955; McOnie, 1964). These non-pathogenic strains have been considered to be saprophytic forms (Sutton & Waterston, 1966) or avirulent strains of G. citricarpa (Kotzé, 2000), but McOnie (1964) considered that these strains belong to a distinct Guignardia species (or, perhaps, variety or form). Baayen et al. (2002) have recently confirmed the latter and have shown that such strains belong to a distinct species, Guignardia mangiferae (anamorph Phyllosticta capitalensis), a common endophyte in many plant families. G. mangiferae can be distinguished from G. citricarpa by cultural, morphological and molecular characters, and has never been found associated with typical black-spot symptoms (Baayen et al., 2002). G. mangiferae is also known as G. endophyllicola, G. psidii, Phyllosticta anacardiacearum, and P. theacearum, all of which are junior synonyms of the same fungus.
This protocol is designed for the diagnosis of the citrus black-spot fungus, G. citricarpa proper, as distinct from the harmless but morphologically similar species G. mangiferae, previously referred to as ‘non-pathogenic strains of G. citricarpa’.
Introduction
Guignardia citricarpa est un pathogène important des Citrus spp. et est présent dans de nombreuses régions agrumicoles y compris en Asie, Australie, Amérique du Sud et sud de l’Afrique (EPPO/CABI, 1997). La maladie n’a pas été signalée en Europe ou en Amérique du Nord. Il s’agit principalement d’une maladie du feuillage et des fruits. Les dépréciations de la peau des fruits (‘tache noire’) les excluent du marché des fruits frais. Les infections importantes à proximité du pédicelle des fruits en développement peuvent entraîner leur chute prématurée. Les pertes peuvent être importantes, ainsi que le coût de la lutte chimique.
Les réglementations phytosanitaires concernent les fruits de Citrus, Fortunella, Poncirus et leurs hybrides1, autres que les fruits de Citrus aurantium qui est résistant. Ils doivent provenir de pays ou de zones reconnues exemptes de ‘souches pathogènes’ de G. citricarpa ou, au minimum, le verger et les fruits doivent être exempts de symptômes causés par les ‘souches pathogènes’ de G. citricarpa. Les réglementations phytosanitaires se réfèrent aux souches de G. citricarpa pathogènes sur Citrus, car des souches non pathogènes et endophytes de G. citricarpa ont été signalées sur des plants de Citrus ne présentant pas de symptômes ainsi que sur des plantes-hôtes autres que Citrus (Chiu, 1955; McOnie, 1964). Ces souches non pathogènes sont considérées comme des formes saprophytes (Sutton & Waterston, 1966) ou des souches non virulentes de G. citricarpa (Kotzé, 2000), mais McOnie (1964) a suggéré qu’elles appartiennent peut-être à une espèce de Guignardia distincte (ou peut-être à une variété ou forme). Baayen et al. (2002) ont récemment confirmé cette dernière hypothèse et ont montré l’appartenance à l’espèce distincte Guignardia mangiferae (anamorphe Phyllosticta capitalensis), endophyte commun sur de nombreuses familles de plantes. G. mangiferae peut être distingué de G. citricarpa par des caractères morphologiques, culturaux et moléculaires, et n’a jamais été trouvé associé avec des symptômes typiques de tache noire (Baayen et al., 2002). G. mangiferae est également connu sous les noms suivants: G. endophyllicola, G. psidii, Phyllosticta anacardiacearum et P. theacearum (tous synonymes du même champignon).
Ce protocole est destiné au diagnostic de G. citricarpa, distinct de l’espèce inoffensive mais morphologiquement semblable G. mangiferae, précédemment appelée ‘souche non pathogène de G. citricarpa’.
Identity
Name: Guignardia citricarpa Kiely
Anamorph: Phyllosticta citricarpa (McAlpine) Van der Aa
Synonyms: Phoma citricarpa McAlpine
Phyllostictina citricarpa (McAlpine) Petrak
Synanamorph: Leptodothiorella sp.
Taxonomic position: Fungi: Ascomycota: Dothideales
Bayer computer code: GUIGCI
Phytosanitary categorization: EPPO A1 list no. 194, EU Annex designation II/A1 (strains pathogenic to citrus).
Identité
Nom: Guignardia citricarpa Kiely
Anamorphe: Phyllosticta citricarpa (McAlpine) Van der Aa
Synonymes: Phoma citricarpa McAlpine
Phyllostictina citricarpa (McAlpine) Petrak
Synanamorphe: Leptodothiorella sp.
Classement taxonomique: Fungi: Ascomycota: Dothideales
Code informatique Bayer: GUIGCI
Catégorisation phytosanitaire: Liste A1 de l’OEPP no. 194; Désignation Annexe UE II/A1 (souches pathogènes aux Citrus).
Detection
Disease symptoms on fruits
Fruit symptoms vary to such an extent that confusion exists regarding their characteristics and description (Schüepp, 1961; Kotzé, 2000). The various types overlap, and the names used to indicate symptom types are not consistent. Symptoms are known as hard spot, shot-hole spot, false melanose, speckled blotch, freckle spot, virulent spot (described below), or types A, B, C, and D lesions (not described here). Three main types exist.
Hard spot/shot-hole spot: shallow lesions with a small central grey to tan crater usually with a dark brown rim, 3–10 mm in diameter (Fig. 1A,C,G). This symptom usually appears after the fruit has started to turn orange or yellow. Often, but not always, pycnidia can be seen inside the spots as tiny and slightly elevated black dots in the grey to tan field (Fig. 1F). A magnifying glass or dissecting microscope is needed to see these clearly.
Symptoms of citrus black spot, caused by Guignardia citricarpa on orange (Citrus sinensis) and lemon (C. limon) fruits. (A) Orange fruit with severe black spot symptoms (the lesions are of the hard-spot type, except for those on the middle and right hand oranges which are beginning to spread, i.e. virulent spot). (B) Lemon fruit with predominantly freckle-spot lesions (the larger lesions contain pycnidia). (C) Orange fruit with freckle and hard-spot lesions. (D and E) Freckle-spot symptoms on orange and lemon fruits (spots are always depressed in the peel, and may be concolorous with the healthy peel – left hand lesions in D and E – or have a dark brown rim – other lesions). (F) Lesions with pycnidia from orange fruits. (G) Hard-spot lesions from orange fruits (pycnidia may or may not be present inside the lesions). (H) Virulent spot on orange fruit (pycnidia are present in some areas).
Symptômes de la maladie de la tache noire, causée par Guignardia citricarpa sur orange (Citrus sinensis) et citron (C. limon). (A) Oranges avec des symptômes sévères de tache noire (les lésions sont de type tache dure, sauf pour les lésions des oranges du centre et de droite qui commencent à se disséminer, c’est-à-dire tache virulente). (B) Citron avec des lésions de type tache de rousseur dominantes (les lésions les plus grandes contiennent des pycnides du champignon). (C) Oranges avec des lésions de tache de rousseur et de tache dure. (D and E) Symptômes de type tache de rousseur sur orange et citrons (les taches sont toujours concaves et peuvent être de la même couleur que la peau saine-lésions de gauche, D et E – ou avoir une bordure brun foncé– autres lésions. (F) Lésions avec pycnides sur oranges. (G) Lésions de type tache dure sur orange (pycnides présentes, ou non, à l’intérieur des lésions). (H) Tache virulente sur orange (pycnides présentes à certains endroits).
(A) Courtesy P. Barkley, copyright Biological and Chemical Research Institute, Rydalmere (AU); (B) courtesy and copyright Centrum voor Landbouwkundig Onderzoek, Merelbeke (BE); (C–G) courtesy and copyright Plant Protection Service, Wageningen (NL).
Freckle spot/speckled blotch/false melanose: on mature fruits, usually after harvest, small (1–3 mm in diameter), slightly depressed spots appear (Fig. 1B, D, E). These spots may be grey to tan, or reddish, or brownish, or not discoloured at all. Often, but not always, they have a dark red or brown rim. Pycnidia are only incidentally present in freckle spot lesions (Fig. 1A). Freckle spots often occur as satellite spots around hard-spot lesions. Many intermediates occur between these spots and the previous type.
Virulent lesions: spots may coalesce to form ‘virulent’ spots (Fig. 1H and the right hand orange lesion in Fig. 1A). This is the most damaging form because it extends deeply into the peel. Spots turn brown to black, develop a leathery texture and may cover the entire fruit.
Disease symptoms on leaves and twigs
Symptoms first appear on mature leaves and petioles as tiny circular red to red-brown spots, visible on both leaf surfaces. With time, the centres of the spots darken with an even darker brown to black ring. Spots remain small, not exceeding 3 mm. Leaf lesions often have yellow halos.
Détection
Symptômes de maladie sur les fruits
Les symptômes sur les fruits varient tellement que leurs caractéristiques et leur description ne sont pas claires (Schüepp, 1961; Kotzé, 2000). Les différents types de symptômes se recoupent, et les noms utilisés pour les désigner ne sont pas cohérents. Les symptômes sont décrits sous la forme de ‘tache dure’, ‘tache criblée’, ‘fausse mélanose’, ‘moucheture’, ‘tache de rousseur’, ‘tache virulente’ (décrits ci-dessous), ou de lésions de type A, B, C et D (qui ne sont pas décrites ici). Trois types principaux existent.
Tache dure/tache criblée: lésions peu profondes, de 3–10 mm de diamètre, avec un petit cratère central gris à marron normalement délimité par une bordure brun foncé (Fig. 1A,C,G). Ces symptômes apparaissent généralement après que le fruit ait commencéà devenir orange ou jaune. Souvent, mais pas toujours, des pycnides peuvent être observées dans les taches sous forme de petits points noirs légèrement convexes dans la partie grise à marron (Fig. 1F). Une loupe ou une loupe binoculaire sont nécessaires pour les observer clairement.
Fausse mélanose/moucheture/tache de rousseur: sur les fruits mûrs, de petites taches (1–3 mm de diamètre) légèrement concaves apparaissent, généralement après la récolte (Fig. 1B,D,E). Elles peuvent être grises, marron, rougeâtres, brunâtres ou être de la même couleur que la partie saine. Elles ont souvent, mais pas toujours, une bordure rouge foncé ou brune. Exceptionnellement, des pycnides sont présentes dans les taches de rousseur (Fig. 1A), qui sont souvent situées autour des taches dures. De nombreux intermédiaires existent entre ces taches et le type de symptômes précédent.
Lésions virulentes: les taches peuvent fusionner pour former des taches virulentes (Fig. 1H et la lésion sur orange à droite sur la Fig. 1A). Il s’agit de la forme qui cause le plus de dégâts car elle s’étend profondément dans la peau. Les taches deviennent brunes à noires, développent une texture qui ressemble à du cuir et couvrent parfois l’ensemble du fruit.
Symptômes de maladie sur les feuilles et les rameaux
Les symptômes apparaissent d’abord sur les feuilles matures et les pétioles sous forme de minuscules taches circulaires rouge à rouge-brun, visibles aux deux faces des feuilles. Avec le temps, le centre des taches s’assombrit et elles s’entourent d’un anneau encore plus foncé, brun à noir. Les taches restent petites et ne dépassent pas 3 mm. Sur les feuilles, les lésions ont souvent des halos jaunes.
Identification
Procedures
The diagnostic procedure for G. citricarpa depends on the material that is to be examined. Plants for planting of Citrus, Fortunella, Poncirus and their hybrids, and also detached leaves or twigs, should be examined by procedure A (below). Spread of G. citricarpa to continents previously free from the disease is assumed to have taken place mainly through infected plants for planting (nursery stock and other plant material, e.g. for botanical gardens), rather than through infected fruits. Indeed, most EPPO countries prohibit the import of plants for planting of these genera from most origins, so procedure A mostly in practice refers to material detained in quarantine. Fruits should be examined by procedures B or C when carrying black spot symptoms indicative of G. citricarpa (hard spot, freckle spot or virulent spot). If pycnidia are present, procedure B should be used and if not procedure C.
Procedure A
Leaves and twigs should be cultured on appropriate media. The cultures obtained should be identified using classical means (growth rate, pigment production, size and shape of the conidia, thickness of the conidial sheath) or PCR testing according to the methods given below. Classical identification of Guignardia-like cultures requires 7–14 days, and is possible as soon as mature pycnidia have been produced. Cultures of G. citricarpa produce the characteristic conidia, grow slowly on cherry agar, and produce a yellow pigment on oatmeal agar (details on growth and morphology are given below under ‘Identification methods’). Guignardia-like cultures that do not produce mature pycnidia within 14 days or do not fulfil the other requirements should be further analysed by PCR testing.
Procedure B
Microscopical preparations should be made from the pycnidia to ensure that the structures seen are G. citricarpa. Acervuli of Colletotrichum gloeosporioides and C. acutatum, anamorphs of two fungi that are commonly present in citrus peel, may look very much like pycnidia. Whereas these species generally live in the peel as harmless endophytes, their acervuli may be present in lesions caused by G. citricarpa. Hyphae of non-pathogenic G. mangiferae may also be present in the lesions, but G. mangiferae does not produce pycnidia in lesions.
Procedure C
Two methods are available for diagnosing black spot lesions without pycnidia. The first relies on incubation for 5 days of detached lesions, cut from the peel, under conditions conducive to pycnidium formation (Brodrick & Rabie, 1970). The fact that, in vitro, these lesions produce pycnidia containing conidia with the size and shape of G. citricarpa confirms that they were caused by G. citricarpa. If no lesions produce pycnidia, the fruits are considered free from the pathogen. The method will not result in false positives, but its efficacy is no more than 50%.
The second method is a direct PCR test on the lesions. The method is based on the use of ITS sequence-based primers with specificity for G. citricarpa and was developed at the University of Oregon (US) and Plant Research International, Wageningen (NL). It has been validated at the Plant Protection Service, Wageningen (NL). The method is rapid (2 days), will not result in false positives and has an efficacy of 90% per lesion. A reliability above 99% can easily be achieved by independent testing of multiple lesions.
Culturing of lesions on appropriate media followed by classical identification of the fungus or PCR testing is also possible. However, this approach is inferior to the previous two methods. Culturing and classical identification will require 14 days, with an efficacy of < 10%. Culturing followed by PCR of cultures is more time-consuming than direct PCR, and no more reliable.
Isolation and culturing of the fungus
Media
Cherry decoction agar (CHA). Simmer 1 kg of cherries (without stones and petioles) in 1 L of boiling tap water for 2 h, filter and bottle. Sterilize bottles for 30 min at 110 °C. Separately sterilize 0.8 L water and 20 g Technical agar no. 3 at 121 °C for 15 min, add 0.2 L of the above cherry extract and mix well (pH 4.5), and resterilize for 5 min at 102 °C.
Potato dextrose agar (PDA). Commercially available (Difco).
Oatmeal agar (OA). Wrap 30 g oatmeal flakes in cloth and hang in pan of tap water; bring to the boil and simmer for 2 h; squeeze and filter through cloth. Sterilize 15 min at 121 °C. Add 20 g Technical Agar no. 3 to 1 L of the oatmeal extract and sterilize 15 min at 121 °C.
Isolation
Plant material (leaves, twigs) should be surface-disinfected with 50% ethanol or 1% sodium hypochlorite for 0.5 min, then dissected and aseptically placed on the isolation medium. Isolations should be made on cherry decoction agar (CHA), a medium on which pycnidia are readily formed, or PDA amended with 50 µg mL−1 penicillin and 50 µg mL−1 streptomycin. Slow-growing, dark cultures possibly representing Guignardia citricarpa should be transferred to CHA for growth-rate testing, and to OA for evaluating pigment production. The original cultures should be placed under near-UV to induce sporulation at 22 °C.
Incubation of lesions for stimulating pycnidium formation
Fruits are disinfected with a tissue drenched in 1% sodium hypochlorite, washed thoroughly with tap water and dried. Parts of the peel carrying black spot lesions without pycnidia are removed with a cork borer (7 mm diameter) or a scalpel blade, and placed aseptically in 9-cm-diameter Petri dishes with wet filter paper at the bottom. The Petri dishes are kept moist and are incubated under continuous illumination for 5 days at 27 °C. After 5 days, lesions are examined for the presence of pycnidia of G. citricarpa (examine a slide preparation under the microscope). When available, 40 lesions should be tested.
Examination of cultured isolates
After 14 days, pycnidia should have formed and a watery squash preparation of the pycnidium (or the conidial slime oozing from it) should be examined under the microscope. Cultures are identified as G. citricarpa when they produce the characteristic conidia, grow slowly on cherry agar, and produce a yellow pigment on oatmeal agar (for details see below). Guignardia-like cultures that do not produce ripe pycnidia within 14 days or do not fulfil the other requirements should be further analysed by PCR testing. Cultures should be retained on CHA slants in a refrigerator (4 °C) and transferred twice a year.
Growth characteristics in culture
Colonies grow slowly (16–33 mm on CHA at 22 °C in 7 days). The mycelium is submerged, dark, forming a plectenchymatous crust (Fig. 2D). Stromata develop within 8 days as hard, black masses, with one to numerous conidial and spermatial cavities in the upper region. Ripe pycnidia generally form in 10–14 days. On OA, high amounts of a distinctive yellow pigment are produced that diffuses into the medium around the colony. The pigment is only weakly produced on other media.
Conidium morphology and colony characteristics after 7 days growth on various media of Guignardia citricarpa and G. mangiferae. (A) Conidia of G. citricarpa with thin mucoid sheath. (B and C) Conidia of G. mangiferae with thick mucoid sheath (C – differential interference contrast – scale bar = 10 µm). (D) Colonies of G. citricarpa growing slowly on oatmeal agar (top), malt extract agar (middle), and cherry decoction agar (bottom) and showing the yellow halo just around the colony (arrows). (E) Colonies of G. mangiferae growing faster and without yellow pigment.
Morphologie conidienne et colonies après 7 jours de croissance sur différents milieux, pour Guignardia citricarpa et G. mangiferae. (A) Conidies de G. citricarpa avec une couche mucoïde fine. (B and C) Conidies de G. mangiferae avec une couche mucoïde épaisse (C – contraste interférentiel différentiel DIC –échelle = 10 µm). (D) Colonies de G. citricarpaà croissance lente sur gélose d’avoine (haut), gélose de malt (milieu), et gélose de cerise (bas), et présentant un halo jaune juste autour de la colonie (flèches). (E) Colonies de G. mangiferaeà croissance plus rapide et sans pigment jaune.
Courtesy W. van Lienden, Plant Protection Service, Wageningen (NL) (cultures); G. Verkleij, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht (NL) (conidia).
Morphology
Data on morphology of G. citricarpa varies considerably, partly because of the confusion about the identity of pathogenic and non-pathogenic strains. The data given below is based on Sutton & Waterston (1966) and van der Aa (1973), as revised and amended by Baayen et al. (2002).
Ascocarps: perithecia exclusively formed on dead leaves, not in fruit or leaf lesions or on media; solitary or aggregated, globose to pyriform, immersed, dark brown to black, 125–360 µm diameter; wall up to five cells thick, sclerotioid on the outside, pseudoparenchymatous and thin-walled within, ostiole papillate, circular, 10–17.5 µm diameter. Paraphyses and periphyses absent.
Asci: clavate cylindrical, shortly stipitate, 8-spored, 40–65 × 12–15 µm; ascus wall thick, bitunicate.
Ascospores: aseptate, hyaline, multiguttulate, cylindrical but swollen in the middle, ends obtuse, each with a colourless appendage, 12.5–16 × 4.5–6.5 µm.
Pycnidia: formed in fruit and leaf lesions, also amphigenous on dead leaves, solitary, sometimes aggregated, globose, immersed, mid-to-dark brown, 70–330 µm diameter, wall up to four cells thick, sclerotioid on the outside, pseudoparenchymatous within, ostiole darker, slightly papillate, circular, 10–15 µm diameter.
Conidia: obovate to elliptical, hyaline, aseptate, multiguttulate, apex slightly flattened with a colourless subulate appendage, base truncate, 9.4–12.7 × 5.0–8.5 µm, surrounded by a barely visible (< 1.5 µm thick) colourless gelatinous coat (Fig. 2A), formed as blastospores from hyaline, unicellular, cylindrical conidiophores up to 9 µm long. Conidia and the conidial sheath are best studied in slide preparations using a microscope equipped with differential interference contrast or, preferentially, using Indian Black ink, in which the sheath will be lucent against a black background.
Spermatial state: in the form-genus Leptodothiorella; formed both in pure culture and on the host; spermatia dumbbell-shaped, seldom cylindrical, straight or slightly curved, 5–8 × 0.5–1 µm.
PCR testing
Primers: a primer pair (GCF3–GCR7) has been developed by G. C. Carroll (University of Oregon, US) and P. J. M. Bonants (Plant Research International, Wageningen, NL) for the detection of G. citricarpa by the polymerase chain reaction (PCR)1. This test differentiates G. citricarpa from the common citrus endophyte, G. mangiferae, and other species of Guignardia, Phyllosticta, and other fungi occurring on citrus fruits. The protocol has been validated on a large, worldwide culture collection of both Guignardia species, and can be directly performed on lesions. No more than two lesions should be extracted and amplified per Eppendorf vial. The primer sequences are GCF3: 5′-AAAAAGCCGCCCGACCTACCT-3′ and GCR7: 5′-TGTCCGGCGGCCAG-3′.
DNA extraction: for testing pure cultures of the fungus, DNA should be extracted using appropriate methods (e.g. Baayen et al., 2002). For testing symptomatic fruits, lesions are dissected from the peel, and placed in 1.5 mL Eppendorf vials with sand in 300 µL cell lysis solution (Puregene-kit Gentra/Biozym). 1.5 µL Proteinase K (20 mg mL−1) is added, the mixture is incubated at 55 °C for 1.5 h, and cooled down to room temperature. 100 µL protein precipitation solution (Puregene-kit Gentra/Biozym) is added, the mixture is vortexed for 20 s, kept on ice for 5 min, centrifuged at 14 000 rev min−1 for 3 min, and the supernatant transferred to a clean Eppendorf vial, mixed with 300 µL isopropanol, and centrifuged at 14 000 rev min−1 for 5 min. The pellet is washed with 70% ethanol, dried, suspended in 20 µL TE buffer (10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, pH 8.0), 1 µL RNAse (4 mg mL−1) is added, and the mixture is incubated at 37 °C for 30 min. The volume is made up to 50 µL with TE buffer, and purified over a spin column (Bio-Rad) filled with PVPP (Sigma).
Amplification and analysis: the reaction mixture should contain 5 µL DNA suspension; 2.5 µL of 10× concentrated reaction buffer containing 1.5 mm MgCl2; 1.5 µL 1 mm dNTPs; 0.25 µL of a 60-µm solution of each primer; 0.25 µL internal control; 0.2 µL Taq DNA polymerase (5 U µL−1; Roche); MilliQ water to final volume of 25 µL). The internal control, developed from heterologous Lolium perenne DNA, is available upon request from P. J. M. Bonants (Plant Research International, Wageningen, NL; for address see below); amplification of 10 pg of the internal standard with the primer pair GCF3–GCR7 will generate a 230-bp amplicon. Amplification is performed in thin-walled PCR tubes in a DNA thermal cycler with heated lid, programmed as follows: 1 cycle for 2 min at 94 °C followed by 30 cycles for 30 s at 94 °C, 30 s at 65 °C, and 60 s at 72 °C. One cycle for 10 min at 72 °C should be conducted after the 30 cycles. After amplification, 10 µL of the reaction mixture is loaded onto a 1.0% agarose gel in 0.5× TBE buffer, separated by electrophoresis, stained with ethidium bromide, and viewed and photographed under UV light. A negative control (no DNA target) should be included in every experiment to test for contamination as well as a positive control (DNA from a reference strain of the pathogen).
The positive control, but not the negative control, should yield an amplicon of 490 bp. Strains yielding an amplicon of this size can be identified as G. citricarpa. Samples not yielding such an amplicon can be considered negative for G. citricarpa only when the 230 bp internal standard amplicon was properly produced.
Identification
Procédures
La procédure de diagnostic pour G. citricarpa dépend du matériel à examiner. Les végétaux destinés à la plantation de Citrus, Fortunella, Poncirus et leurs hybrides, ainsi que des feuilles détachées ou de rameaux, doivent être examinés par la procédure A (ci-dessous). La dissémination de G. citricarpa vers des continents précédemment exempts de la maladie s’est sûrement produite à cause de matériel de pépinière infecté, ou autre matériel végétal (par ex. destiné aux jardins botaniques), plutôt que par des fruits infectés. En fait, la plupart des pays OEPP interdisent l’importation de végétaux destinés à la plantation de ces genres de la plupart des origines, et la procédure A concerne en pratique surtout du matériel détenu en quarantaine. Les fruits doivent être examinés par les procédures B ou C lorsqu’ils portent des symptômes de tache noire indicatifs de G. citricarpa (tache dure, fausse mélanose ou lésions virulentes). Si des pycnides sont présentes, la procédure B doit être utilisée. Dans le cas contraire, utiliser la procédure C.
Procédure A
Mettre en culture des feuilles et des rameaux sur un milieu approprié. Identifier les cultures obtenues, à l’aide de méthodes classiques (taux de croissance, production de pigment, taille et forme des conidies, épaisseur de l’enveloppe conidienne) ou de la PCR, selon les méthodes décrites ci-dessous. L’identification classique des cultures pouvant être Guignardia demande 7–14 jours et elle est possible dès que des pycnides mûres ont été produites. Les cultures de G. citricarpa produisent des conidies caractéristiques, se développent lentement sur gélose de cerise, et produisent un pigment jaune sur gélose d’avoine (des détails sur la croissance et la morphologie sont donnés ci-dessous sous ‘méthodes d’identification’). Les cultures pouvant être Guignardia mais qui ne produisent pas de pycnides mûres en 14 jours ou ne remplissent pas les autres exigences doivent être analysées par PCR.
Procédure B
Des préparations microscopiques des pycnides doivent être préparées pour s’assurer que les structures observées sont celles de G. citricarpa. Les acervules de Colletotrichum gloeosporioides et C. acutatum, anamorphes de deux champignons communs sur la peau des Citrus, ressemblent parfois beaucoup à des pycnides. Ces espèces sont en général des endophytes inoffensifs de la peau, mais leurs acervuli sont parfois présentes dans les lésions de G. citricarpa. Les hyphes de G. mangiferae (non pathogène) peuvent également être présentes dans les lésions, mais G. mangiferae ne produit pas de pycnides dans les lésions.
Procédure C
Deux méthodes peuvent être utilisées pour le diagnostic des lésions de G. citricarpa en l’absence de pycnides. La première utilise l’incubation pendant 5 jours de lésions découpées dans la peau, en conditions favorables à la formation de pycnides (Brodrick & Rabie, 1970). La présence de lésions produisant des pycnides contenant des conidies ayant la taille et la forme de celles de G. citricarpa confirme que ces lésions sont dues àG. citricarpa. Les fruits sur lesquels aucune lésion ne produit de pycnides sont considérés exemptes du pathogène. La méthode ne produit pas de faux-positifs, mais son efficacité ne dépasse pas 50%.
La deuxième méthode est un test de PCR direct sur les lésions. Elle repose sur l’utilisation d’amorces spécifiques pour G. citricarpa basées sur la séquence ITS. Cette méthode a été mise au point par l’Université d’Oregon (US) et Plant Research International, Wageningen (NL) et a été validée par le Service de protection des végétaux, Wageningen (NL). La méthode est rapide (2 jours), ne produit pas de faux-positifs et a une efficacité de 90% par lésion. Une fiabilité supérieure à 99% peut être facilement obtenue par des tests indépendants sur des lésions multiples.
La culture de lésions sur un milieu approprié suivie de l’identification classique du champignon ou de test PCR est aussi possible. Cependant, cette approche est moins bonne que les deux méthodes précédentes. La mise en culture et l’identification classique demandent 14 jours, avec une efficacité inférieure à 10%. La mise en culture suivie de la PCR demande plus de temps que la PCR directe, et n’est pas plus fiable.
Isolement et culture du champignon
Milieu de culture
Gélose de cerise (CHA): amener àébullition 1 kg de cerises (sans noyaux ni queues) dans 1 L d’eau du robinet et laisser mijoter pendant 2 h. Filtrer et mettre en bouteilles. Stériliser 30 min à 110 °C. Stériliser séparément 0,8 L d’eau et 20 g de gélose technique no. 3 à 121 °C pendant 15 min, ajouter 0,2 L de l’extrait de cerise ci-dessus, bien mélanger (pH 4,5), et stériliser à nouveau pendant 5 min à 102 °C.
Gélose de pomme de terre-dextrose (PDA): commercialisée (Difco).
Gélose d’avoine (OA): envelopper 30 g de flocons d’avoine dans un linge et suspendre dans une casserole d’eau du robinet; amener àébullition et laisser mijoter pendant 2 h; presser et filtrer à travers le linge. Stériliser pendant 15 min à 121 °C. Ajouter 20 g de gélose technique no. 3 à 1 L de l’extrait d’avoine et stériliser pendant 15 min à 121 °C.
Isolement
Le matériel végétal (feuilles, rameaux) doit être désinfecté en surface avec de l’éthanol à 50% ou de l’hypochlorite de sodium à 1% pendant 0,5 min, puis être disséqué et placé en conditions aseptiques sur le milieu d’isolement. Les isolements doivent être réalisés sur gélose de cerise (CHA), milieu sur lequel les pycnides sont facilement formées, ou sur gélose de pomme de terre-dextrose à laquelle on rajoute de la pénicilline pour une concentration finale de 50 µg mL−1 et de la streptomycine pour une concentration finale de 50 µg mL−1. Les cultures sombres à croissance lente pouvant être Guignardia citricarpa doivent être transférées sur CHA pour un test du taux de croissance, et sur OA pour évaluer la production de pigments. Les cultures initiales doivent être exposées aux UV proches pour induire la sporulation à 22 °C.
Incubation de lésions pour stimuler la formation des pycnides
Désinfecter les fruits avec du papier absorbant trempé dans de l’hypochlorite de sodium à 1%, les laver soigneusement à l’eau du robinet et les sécher. Les parties de la peau portant des lésions sans pycnides sont prélevées avec une tarière àécorce (7 mm de diamètre) ou une lame de scalpel, et placées en conditions aseptiques dans des boites de Petri de 9 cm de diamètre tapissées d’un papier filtre humide. Les boites de Petri sont gardées humides et incubées sous lumière continue pendant 5 jours à 27 °C. Après 5 jours, les lésions sont examinées pour la présence de pycnides de G. citricarpa (examiner une préparation au microscope). 40 lésions doivent être testées (si elles sont présentes).
Examen des isolats en culture
Après 14 jours, les pycnides se sont formées et une préparation aqueuse des pycnides (ou des exsudats conidiens qui en sortent) est examinée au microscope. Les cultures sont identifiées comme étant G. citricarpa lorsqu’elles produisent les conidies caractéristiques, se développent lentement sur gélose de cerise et produisent un pigment jaune sur gélose d’avoine (voir des détails ci-dessous). Les cultures pouvant être Guignardia et qui ne produisent pas de pycnides mûres en 14 jours ou ne remplissent pas les autres exigences doivent être analysées par PCR. Les cultures doivent être conservées sur milieu CHA incliné au réfrigérateur (4 °C) et repiquées deux fois par an.
Caractéristiques de croissance en culture
Les colonies se développent lentement (16–33 mm sur CHA à 22 °C en 7 jours). Le mycélium est immergé, sombre et forme une croûte plectenchymateuse (Fig. 2D). Les stromas se développent en 8 jours et constituent des masses dures et noires, avec une ou de nombreuses cavités conidiennes ou spermatiennes dans leur partie supérieure. Les pycnides sont normalement mûres après 10–14 jours. Sur OA, de grandes quantités de pigment jaune caractéristique sont produites et diffusent dans le milieu autour de la colonie. La production de pigment est faible sur les autres milieux.
Morphologie
Les données sur la morphologie de G. citricarpa varient considérablement, en partie à cause des confusions sur l’identité des souches pathogènes et non pathogènes. Les données ci-dessous sont tirées de Sutton & Waterston (1966) et van der Aa (1973), et ont été révisées et amendées par Baayen et al. (2002).
Ascocarpes: périthèces formés exclusivement sur les feuilles mortes, et pas dans les lésions des fruits, feuilles ou milieux de culture; solitaires ou agrégés, globuleux ou piriformes, immergés, brun sombre à noir, 125–360 µm de diamètre; paroi jusqu’à cinq cellules d’épaisseur, sclérotioïdes à l’extérieur, pseudoparenchymateuse et à paroi fine à l’intérieur, à papilles et ostioles, circulaires, 10–17,5 µm de diamètre. Paraphyses et périphyses absentes.
Asques: claviformes cylindriques, à stipes courts, à huit spores, 40–65 × 12–15 µm, paroi épaisse, bituniquées.
Ascospores: sans cloison, hyalines, à plusieurs guttules, cylindriques mais renflées au centre, extrémité obtuse, chacune avec un appendice incolore, 12,5–16 × 4,5–6,5 µm.
Pycnides: formées dans les lésions des fruits et des feuilles, également amphigènes sur les feuilles mortes, solitaires, parfois agrégées, globuleuses, immergées, de couleur brun moyen à foncé, 70–330 µm de diamètre, paroi jusqu’à quatre cellules d’épaisseur, sclérotioïde à l’extérieur, pseudoparenchymateuse à l’intérieur, ostiole plus sombre, légèrement papillé, circulaire, 10–15 µm de diamètre.
Conidies: obovoïdes à elliptiques, hyalines, sans cloison, à plusieurs guttules, apex légèrement aplati avec un appendice subulé incolore, base caduque, 9,4–12,7 × 5,0–8,5 µm, entourées d’une couche incolore et gélatineuse à peine visible (< 1,5 µm d’épaisseur) (Fig. 2A), formées comme blastospores sur des conidiophores hyalins, unicellulaires, cylindriques et mesurant jusqu’à 9 µm de longueur. Les conidies et leurs enveloppes sont étudiées de préférence avec un microscope équipé de contraste interférentiel différentiel (DIC) ou, de préférence, à l’aide d’encre de Chine noire, dans laquelle la couche externe sera brillante sur un fond noir.
Stade spermatien: du type Leptodothiorella; formés en culture pure et sur l’hôte; spermaties en forme d’haltères (rarement cylindriques), droites ou légèrement incurvées, 5–8 × 0,5–1 µm.
Test de PCR
Amorces: une paire d’amorces (GCF3–GCR7) a étéélaborée par G. C. Carroll (Université d’Oregon, US) et P. J. M. Bonants (Plant Research International, Wageningen, NL) pour la détection de G. citricarpa par PCR1. Ce test permet de distinguer G. citricarpa de l’endophyte commun des citrus G. mangiferae et des autres espèces de Guignardia, Phyllosticta et autres champignons présents sur les fruits de Citrus. Le protocole a été validé sur une vaste collection mondiale des deux espèces de Guignardia, et peut être appliqué directement sur les lésions. Deux lésions au plus doivent être extraites et amplifiées pour chaque microtube de type Eppendorf. Les séquences des amorces sont GCF3: 5′-AAAAAGCCGCCCGACCTACCT-3′ et GCR7: 5′-TGTCCGGCGGCCAG-3′.
Extraction de l’ADN: pour le test des cultures pures, l’ADN fongique doit être extrait à l’aide de méthodes appropriées (par ex. Baayen et al., 2002). Pour le test des fruits présentant des symptômes, des lésions sont prélevées sur la peau, et mises dans des microtubes de 1,5 mL avec du sable dans 300 µL d’une solution de lyse cellulaire (Puregene-kit Gentra/Biozym). 1,5 µL de Proteinase K (20 mg mL−1) sont ajoutés, le mélange est incubéà 55 °C pendant 1,5 h et refroidi à température ambiante. 100 µL d’une solution de précipitation protéique (Puregene-kit Gentra/Biozym) sont ajoutés, le mélange est agité au vortex pendant 20 s, conservé sur glace pendant 5 min et centrifugéà 14 000 rev min−1 pendant 3 min. Le surnageant est transféré dans un microtube de 1,5 mL stérile, mélangéà 300 µL d’isopropanol et centrifugéà 14 000 rev min−1 pendant 5 min. Le dépôt est lavé avec de l’éthanol à 70%, séché et mis en suspension dans 20 µL de tampon TE (10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, pH 8.0). 1 µL d’ARNse (4 mg mL−1) est ajouté et le mélange est incubéà 37 °C pendant 30 min. Le volume est complétéà 50 µL avec du tampon TE et purifié dans une colonne Spin (Bio-Rad) remplie de PVPP (Sigma).
Amplification et analyse: le mélange réactionnel contient: 5 µL de suspension d’ADN; 2,5 µL de tampon de réaction 10× contenant 1,5 mm MgCl2; 1,5 µL d′1 mm dNTPs; 0,25 µL d’une solution de 60 µm de chaque amorce; 0,25 µL de témoin interne; 0,2 µL de polymérase Taq (5 U µL−1; Roche); 15,05 µL d’eau MilliQ (volume final 25 µL). Le témoin interne, développéà partir de d’ADN de Lolium perenne hétérologue, est disponible sur demande auprès de P. J. M. Bonants (Plant Research International, Wageningen, NL; voir l’adresse ci-dessous); l’amplification de 10 pg du témoin interne avec la paire d’amorces GCF3–GCR7 génère un amplicon de 230 pb. L’amplification doit être réalisée dans des tubes de PCR à paroi fine dans un thermocycleur à couvercle chauffant, programmé ainsi: un cycle de 2 min à 94 °C, suivi de 30 cycles de 30 s à 94 °C, 30 s à 65 °C et 60 s à 72 °C, et enfin un cycle de 10 min à 72 °C. Après l’amplification, 10 µL du mélange de réaction sont mis sur un gel d’agarose à 1,0% dans un tampon TE 0,5×, soumis àélectrophorèse, colorés au bromure d’éthidium, et observés et photographiés sous UV. Un témoin négatif (sans ADN cible) doit être inclus dans chaque expérience pour tester la contamination, ainsi qu’un témoin positif (ADN d’une souche de référence du pathogène).
Le témoin positif, mais pas le témoin négatif, doit produire un amplicon de 490 pb. Les souches produisant un amplicon de cette taille sont identifiées comme étant G. citricarpa. Les échantillons ne produisant pas d’amplicon de cette taille peuvent être considérés négatifs pour G. citricarpa seulement si l’amplicon de 230 pb du témoin interne a été correctement produit.
Comparison with similar species
Lesions caused by G. citricarpa can be very similar to those caused by Alternaria alternata pv. citri, Colletotrichum spp., Diaporthe citri, Mycosphaerella citri, Septoria spp., mechanical and insect damage (Snowdon, 1990). In particular, Alternaria alternata pv. citri and Colletotrichum spp. may cause small, sharply black-rimmed, depressed lesions that are closely similar to tiny black-spot lesions. By themselves, symptoms are not always sufficiently distinctive. It follows that diagnosis relies either on culturing the fungus (or incubation of lesions) followed by classical identification of the fungus, or on direct PCR testing of the lesion.
In pure culture, G. citricarpa (Fig. 2D) closely resembles the common citrus endophyte G. mangiferae (Fig. 2E). PCR testing according to the present protocol will produce a 490-bp amplicon only with G. citricarpa. Classical identification is possible by combining pigmentation on OA (a yellow pigment is produced by most strains of G. citricarpa but not by G. mangiferae), growth rate on CHA (G. citricarpa < 35 mm diameter in 7 days on CHA; G. mangiferae generally > 40 mm diameter although the range of the latter overlaps with that of G. citricarpa), and thickness of the mucoid conidial sheath [< 1.5 µm in G. citricarpa (Fig. 2A); > 1.5 µm in G. mangiferae (Fig. 2B,C)]. Upon prolonged culturing, only G. mangiferae will produce perithecia.
Comparaison avec des espèces similaires
Les lésions causées par G. citricarpa peuvent être très similaires à celles d’Alternaria alternata pv. citri, Colletotrichum spp., Diaporthe citri, Mycosphaerella citri, Septoria spp., ainsi qu’à des dégâts mécaniques ou d’insectes (Snowdon, 1990). Alternaria alternata pv. citri et Colletotrichum spp., en particulier, peuvent provoquer de petites lésions concaves nettement délimitées de noir et ressemblant beaucoup à des petites lésions de la maladie des taches noires. Les symptômes ne sont donc pas toujours suffisamment distinctifs en eux-mêmes. Par conséquent, le diagnostic repose soit sur la culture du champignon (ou l’incubation des lésions) suivie de l’identification classique, soit sur le test de PCR direct des lésions.
En culture pure, G. citricarpa (Fig. 2D) ressemble fortement à l’endophyte commun des agrumes G. mangiferae (Fig. 2E). Le test de PCR du présent protocole produit un amplicon de 490 pb seulement avec G. citricarpa. L’identification classique est possible en combinant la pigmentation sur OA (pigment jaune produit par la plupart des souches de G. citricarpa, et pas par G. mangiferae), le taux de croissance sur CHA (G. citricarpa < 35 mm de diamètre en 7 jours; G. mangiferae généralement > 40 mm de diamètre en 7 jours bien que ce taux recoupe parfois celui de G. citricarpa), et l’épaisseur de la couche mucoïde conidienne [< 1,5 µm chez G. citricarpa (Fig. 2A); > 1,5 µm chez G. mangiferae (Fig. 2B,C)]. En cas de culture prolongée, seul G. mangiferae produit des périthèces.
Reference cultures
Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, the Netherlands. Fax +31 30 251 2097.
Cultures de référence
Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Netherlands. Fax +31 30 251 2097.
Requirements for a positive identification
The procedures for diagnosis and identification described in this protocol should have been followed.
The fungus should have been identified unambiguously through the presence of pycnidia with the characteristic conidia inside the lesions, or through culturing and classical morphology, or through PCR testing.
The disease symptoms, growth characteristics and morphology of the fungus, and/or PCR amplicon produced should be in accordance with the descriptions in the protocol. In the case of PCR testing, the positive but not the negative control should have produced a 490-bp amplicon, and the internal standard should have produced an 230-bp amplicon.
Exigences pour une identification positive
Les procédures de détection et d’identification décrites dans ce protocole doivent avoir été suivies.
Le champignon doit avoir été identifié sans ambiguïté par la présence dans les lésions de pycnides et conidies caractéristiques, ou par la mise en culture et la morphologie classique, ou par PCR.
Les symptômes de maladie, les caractéristiques de croissance et de morphologie du champignon et les amplicons de PCR produits doivent être conformes aux descriptions données dans ce protocole. Dans le cas des tests de PCR, le témoin positif (mais pas le témoin négatif) doivent avoir produit un amplicon de 490 pb, et le témoin interne doit avoir produit un amplicon de 230 pb.
Report on the diagnosis
A report on the execution of the protocol should include:
- •
information on the origin of the infected material;
- •
an indication of the magnitude of the infection (how many fruits, leaves or twigs were infected);
- •
a description of the disease symptoms (preferably including photographs), showing whether or not pycnidia and conidia were present inside these;
- •
if pycnidia and conidia were not present inside lesions, an indication of the method followed for diagnosis;
- •
if the fungus was cultured, a description of the growth characteristics and sporulation of the fungus in vitro, and a description of the conidia produced in culture, the pigmentation of the culture on OA, and the growth rate on CHA (preferably including drawings or photographs);
- •
if the lesions were incubated, a description of the pycnidia containing conidia of G. citricarpa;
- •
if cultures, leaves, twigs or fruit lesions were PCR-tested, confirmation of the PCR results, including prints of the PCR analyses;
- •
comments on the certainty or uncertainty of the identification.
If possible, a pure culture of the pathogen should be retained. The examined plant material need not be retained.
Rapport sur le diagnostic
Le rapport sur la mise en oeuvre du protocole doit comporter:
- •
des informations sur l’origine du matériel infecté;
- •
l’étendue de l’infection (nombre de fruits, feuilles ou rameaux infectés);
- •
une description des symptômes de maladie (de préférence avec des photographies), montrant la présence ou l’absence de pycnides et de conidies dans les lésions;
- •
s’il n’y a pas de pycnides et de conidies dans les lésions, des précisions sur la méthode utilisée pour le diagnostic;
- •
si le champignon a été mis en culture, une description des caractéristiques de croissance et de sporulation du champignon in vitro, une description des conidies produites en culture, de la pigmentation de la culture sur gélose d’avoine (OA) et du taux de croissance sur gélose de cerise (CHA) (avec de préférence des dessins ou photographies);
- •
si les lésions sont incubées, une description des pycnides, contenant des conidies de G. citricarpa;
- •
si les cultures, ou les lésions sur les feuilles, rameaux ou fruits, ont été testées par PCR, une confirmation des résultats de la PCR, y compris des impressions des analyses;
- •
des commentaires sur les certitudes ou les doutes sur l’identification.
Si possible, une culture pure du pathogène doit être conservée. Lorsque cela est possible, il n’est pas nécessaire de conserver le matériel végétal étudié.
Footnotes
Further information/Renseignements supplémentaires
Further information on this organism can be obtained from:/Des renseignements supplémentaires sur cet organisme peuvent être obtenus auprès de:
Mycology Section, Plant Protection Service, PO Box 9102, 6700 HC Wageningen, Netherlands (Fax +31 317 421 701; Tel. +31 317 496 111).
Inquiries about the availability of the PCR primers should be directed to Dr Philip Loux via e-mail ([email protected]) or by mail to the Office of Technology Transfer, 1238 University of Oregon, Eugene, OR 97403, USA (attn of Dr Philip Loux).
Acknowledgements/Remerciements
This protocol was originally drafted by:/Ce protocole a été initialement préparé par
R. P. Baayen, Plant Protection Service, Wageningen (Netherlands)
P. J. M. Bonants, Plant Research International, PO Box 26, 6700 AA Wageningen (Netherlands)
G. C. Carroll, 1210 University of Oregon, Eugene, Oregon (USA)
