Identification of indigenous and introduced symbiotic fungi in ectomycorrhizae by amplification of nuclear and mitochondrial ribosomal DNA

We used the polymerase chain reaction (PCR) to amplify specific regions of the nuclear and mitochondrial genomes of fungi using DNA extracted from pure cultures as well as that directly from ectomycorrhizal rootlets. The internal transcribed spacer (ITS) of the nuclear ribosomal repeat unit and a portion of the mitochondrial large subunit ribosomal RNA gene were chosen as target sequences because both exist in high copy number and amplification primers for both discriminate between plant and fungal DNAs. These features provided a sensitivity and specificity sufficient for detection and analysis of a single mycorrhizal rootlet. We evaluated the variations in the amplified products with regard to the length, restriction endonuclease sites, and primary sequence for use in identification of genera, species, and strains of ectomycorrhizal fungi, with particular attention to selected Laccaria species. Accidental contamination of jack pine seedlings by Telephora terrestris was easily recognized. Amplification and direct DNA sequencing of a portion of the ITS were done for three strains of L. bicolor, one of L. laccata, one of L. proximo, and one of T. terrestris. The nucleotide sequence variation was 32% between L. bicolor and T. terrestris, and it ranged from 3 to 5% among the three Laccaria species examined and from 1 to 2% within L. bicolor. The degree of variation observed is sufficient to allow the use of specific oligonucleotides to characterize amplified ITS products. To demonstrate the feasibility of this approach we designed and tested a probe that enabled two isolates of L. bicolor to be distinguished by a single base-pair difference in a filter-based hybridization assay. In combination these methods now provide an important set of tools for the study of mycorrhizal ecology. Key words: internal transcribed spacer, LrDNA gene, mycorrhizal ecology, polymerase chain reaction, rDNA.

Nous utilisons la réaction enzymatique d'amplification in vitro ou réaction de polymérase en chaîne pour amplifier certaines régions du génôme nucléaire et mitochondrial de champignons. L'ADN extrait de cultures pures et de mycorhizes constitue le matériel de départ. La région intergénique transcrite (ITS) de l'unité répétée nucléaire codant pour les ARNs ribosomiques et une portion du gène mitochondrial codant pour l'ARN de la large sous-unité ribosomique sont choisies comme séquences cibles parce qu'elles existent en multiples copies dans la cellule et les amorces d'amplification utilisées pour chacune des deux régions permettent de discriminer l'ADN de la plante de celui du champignon. Ces caractéristiques se traduisent par une spécificité et une sensibilité suffisantes pour la détection et l'analyse du composant fongique à partir d'une seule mycorhize. Nous évaluons les produits d'amplification pour les différences de taille, la présence de sites de restriction et la séquence en nucléotides en vue d'utiliser ces variations pour identifier des genres, des espèces et des isolats de champignons ectomycorhiziens, une attention particulière est accordée à des champignons du genre Laccaria. La présence d'un champignon ectomycorrhizien contaminant, le Thelephora terrestris, sur des plants de pin gris inoculés avec du Laccaria bicolor est aisément détectée. Nous séquençons une portion de l’ITS chez trois souches de L. bicolor, une de L. laccata, une de L. proxima et une de T. terrestris. La variation en séquence des nucléotides est de 32% entre L. bicolor et T. terrestris, varie de 3 à 5% entre les trois espèces de Laccaria examinées et de 1 à 2% entre les trois souches de L. bicolor. Ce niveau de variation est suffisant pour permettre l'utilisation de sondes oligonucléotidiques spécifiques. Pour démontrer la faisabilité de cette approche, nous définissons et testons une telle sonde. Par hybridation sur filtre, elle nous permet de distinguer deux isolats de L. bicolor qui diffèrent par une seule paire de bases. L'ensemble de ces méthodes apporte une importante panoplie d'outils qui pourront être utilisés pour l'étude de l'écologie des mycorhizes. Mots clés : région intergénique transcrite, ADN mitochondrial de la large sous-unité ribosomique, écologie des mycorhizes, réaction de polymérase en chaîne, ADN ribosomiques.